你們細(xì)胞是怎么凍存的?求解!!!我的是4度冰箱放半小時(shí),-20度冰箱半小時(shí),然后轉(zhuǎn)移到-80度冰箱!但是放在-80度冰箱1個(gè)月后,細(xì)胞復(fù)蘇就感覺(jué)狀態(tài)不太好了!!
做實(shí)驗(yàn)前要先學(xué)會(huì)凍存，以備自己在后面的實(shí)驗(yàn)中能保持同一來(lái)源、穩(wěn)定可靠的細(xì)胞，且可減少污染或其它不利影響。
1、影響凍存細(xì)胞活性的因素
（1）細(xì)胞凍存保護(hù)劑：常用的有二甲基亞砜（DMSO）和甘油，常用的濃度為5%-10%（90%小牛血清）。DMSO對(duì)二倍體細(xì)胞的毒性較甘油小。
（2）細(xì)胞懸液的凍結(jié)速度：慢凍時(shí)冰凍在細(xì)胞外形成，因此不致?lián)p害細(xì)胞。多數(shù)細(xì)胞以每分鐘下降1℃的速度，降至-20℃凍結(jié)。均可獲得滿意效果。
（3）保存溫度：液氮罐，可達(dá)到-196℃，此時(shí)所有的物理化學(xué)活動(dòng)均降至zui低限度，以保證細(xì)胞長(zhǎng)期保存。
（4）復(fù)蘇：急速融化復(fù)蘇可防止損害細(xì)胞。凍結(jié)細(xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃~43℃的水浴中，30秒至一分鐘內(nèi)融化。
了解了影響凍存的因素，上海恒遠(yuǎn)生物在為您解析八大要素，用于保存細(xì)胞株。歡迎閱讀參考。
1. 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。
2. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈zui近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。
3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
4. 將培養(yǎng)使胰酶浸沒(méi)整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s，立馬豎起對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰酶消化的zui適時(shí)機(jī)。若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過(guò)度；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒(méi)細(xì)胞層1s后迅速豎起對(duì)著燈光觀察細(xì)胞情況，可反復(fù)幾次，直至出現(xiàn)針孔樣縫隙和1-2個(gè)細(xì)胞脫落的*消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。
5. 吸取1ml細(xì)胞凍存液于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞*脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。
6. 將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入新的保種管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。
7. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。
8. 將保種管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過(guò)一夜，次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天，zui后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長(zhǎng)期保存。
注此過(guò)程也可簡(jiǎn)化因?qū)嶋H操作過(guò)程中經(jīng)驗(yàn)所得：步驟7結(jié)束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內(nèi)4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存細(xì)胞株2-3月。
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