細胞培養?咋培養?

    細胞培養，看似簡單的一個實驗，卻不知道把多少英雄豪杰折磨的意欲“自掛東南枝”。今天恒遠生物就為大家盤整理出了一篇養細胞的注意事項，養細胞可不同于養閨女，稍微磕磕碰碰，一切就重新來過！希望廣大科研汪能與細胞愉快的玩耍呦！

    （一）冷凍管應如何解凍 

    取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管的爆裂。

    （二）細胞冷凍管解凍培養時，DMSO如何處理

    在細胞解凍之后，可直接離心去除DMSO，用新鮮的培養基懸浮后直接放入含有 新鮮培養基的培養角瓶中進行細胞培養，如此可避免解凍后細胞生長受到DMSO影響。

    （三）可否使用與原先培養條件不同的培養基

    每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供培養條件不同的培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活，不應該馬上替換。 

    （四）可否使用與原先培養條件不同的血清種類

    血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

    （五）何謂 FBS，FCS，CS，HS 

    FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。 

    （六）培養細胞時應使用 5% 或 10% CO2 

    一般培養基中大都使用 HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺ 作為 pH 的緩沖系統，而培養基中 NaHCO₃ 的含量將決定細胞培養時應使用的 CO₂ 濃度。理論當培養基中 NaHCO₃ 含量為每公升 3.7 g 時，細胞培養時應使用 10% CO₂；當培養基中 NaHCO₃ 為每公升 1.5 g 時，則應使用 5% CO₂ 培養細胞。 

    （七）何時須更換培養基。培養基中是否須添加抗生素。

    視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換時間，按時更換培養基即可。 

    一般正常培養狀態下，培養基中可以添加抗生素。 按1％體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL。 

    (八）貼壁細胞傳代時所使用的trypsin-EDTA濃度及相應處理

    一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為0.25%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。*開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin的活性降低，并可減少污染的機會。

    （九）將一般動物細胞離心下來，離心速率多少

    回收動物細胞，其離心速率一般為1000 rpm，5-10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。 

    （十）細胞的接種密度 

    依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。

    （十一）細胞冷凍培養基的成分及DMSO的等級

    動物細胞冷凍保存時常使用的冷凍培養基是含 5-10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即為無菌狀況，首次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中避光保存。

    （十二）冷凍保存細胞的方法及冷凍細胞濃度

    將貼壁細胞消化后離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以含有DMSO*培養基或胎牛血清的凍存液重懸細胞至終濃度約1x106/ml。。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。 

    冷凍管內細胞數目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

    （十三）如何避免細胞污染

    細胞污染的種類可分成細菌、真菌、霉菌、病毒等。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染的方法。

    （十四）支原體 （mycoplasma）污染的細胞， 對細胞培養有何影響

    不能以肉眼觀察出支原體污染異狀。除極有經驗的專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨。

    支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數，代謝及研究任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結果的數據方有意義。

    （十五）培養基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏暗紅色，且 pH 值會越來越偏堿性

    培養基保存于4 ℃冰箱中，培養基內的 CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性，而培養基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿的結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾 CO2 ，以調整 pH 值。或酸堿調PH。

    （十六）L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

    L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

    （十七）什么培養基中可以省去加酚紅？培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？

    酚紅在培養基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。 

    丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 

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