很多人第一次做ELISA實驗，覺得真簡單，無非就是加樣，保溫，洗滌等操作步驟。可是第二次做ELISA實驗，實驗結果怎么差那么多？同一份樣本怎么可能呢？第三次做ELISA，決定認真一些，實驗結果還是不盡人意，誒，也太難了！今天小編就給大家總結一下ELISA實驗要點，掌握這些，實驗So easy！
ELISA實驗操作注意要點
一、加樣
在 ELISA 中除了包被外，一般需進行 4－5 次加樣。在定性測定中有時不強調加樣量的準確性，例如規定為加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。標本和結合物的稀釋液應按規定配制。加樣時應將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現氣泡。
1. 吸取樣品時，加樣槍吸頭不應黏附多余的液體；加樣時不可90度向孔中滴加液體，這樣會導致液體殘留在吸頭上，加樣不準確！
2. 不要將吸頭伸入孔中，一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭，另一方面可能會將孔中的液體吹起來，加樣不準確！
3.正確的加樣方法應為45度，吸頭貼著孔壁加入，應注意：
①角度太小，會使液體殘留在孔壁上，導致加樣不準確！
②吸頭應當貼著管壁和液面的交界處！
二、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應，即加標本后和加結合物后，此時反應的溫度和時間應按規定的要求，保溫容器好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各 ELISA 板不應疊在一起。為避免蒸發，板上應加蓋，或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于 20℃，ELISA 板可避光放在實驗臺上，以便不時觀察，待對照管顯色適當時，即可終止酶反應。
三、洗滌
洗滌在 ELISA 過程中不是反應聚，但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯待塑料對蛋白質的吸附作用是普遍性的。因此在 ELISA 測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。在標本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質，常作為助溶劑。根據脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號，結合月桂酸的為聚山梨酯 20，在 ELISA 中為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。
洗滌如不*，特別在后一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標抗體作用而產生干擾。
ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法：
①吸干孔內反應液；
②將洗滌液注滿板孔；
③放置 2 min，略作搖動；
④吸干孔內液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數一般為 3～4 次，有時甚至需洗 5～6 次。
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