Western 免疫印跡具體操作說明書

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實(shí)驗(yàn)試劑

1. SDS-PAGE試劑:見電泳實(shí)驗(yàn)。
2. 勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01M PBS中。
6. 顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H2O2 1.0μl。

實(shí)驗(yàn)步驟


1. 蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
2. 電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。
3. 轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）

   (1) 電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。

   (2) 膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。

   (3) 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對比。
4. 免疫反應(yīng)：

   (1) 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

   (2) 加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2hr。

   (3) 棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

   (4) 加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

   (5) 棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。

   (6) 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2hr。
   (7) 棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

   (8) 加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

注意事項(xiàng)


1. 一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定*條件。
2. 顯色液必須新鮮配置使用，zui后加入H2O2。
3. DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細(xì)。